Coltura microbiologica su terreno selettivo

Come funziona

Un batterio vivo, messo su un terreno nutritivo alla temperatura giusta, si moltiplica fino a formare una colonia visibile a occhio nudo. Ogni colonia corrisponde idealmente a una cellula (o a un piccolo gruppo) presente nel campione: per questo il risultato si esprime in UFC, unità formanti colonia.

I terreni sono selettivi, perché contengono sostanze che bloccano la crescita dei batteri non cercati, e differenziali, perché contengono substrati che colorano in modo diverso le colonie in base agli enzimi che possiedono. Nel terreno per coliformi ed E. coli, ad esempio, le colonie di E. coli assumono un colore diverso da quelle degli altri coliformi grazie all'enzima β-glucuronidasi.

Dal campione al risultato

Per E. coli, coliformi ed enterococchi si filtrano 100 mL di campione su una membrana sterile, che viene poi appoggiata sul terreno e incubata: circa 21 ore a 36 °C per coliformi ed E. coli, 44 ore a 36 °C per gli enterococchi. Le colonie tipiche vengono contate ed eventualmente confermate.

Per la Legionella il procedimento è più lungo: si concentra un volume maggiore (di solito 1 litro), si tratta il concentrato con calore o acido per ridurre la flora che compete, si semina su terreni specifici e si incuba per 7-10 giorni, seguiti dalla conferma delle colonie sospette. È il motivo per cui un'analisi di Legionella richiede più tempo di un'analisi microbiologica di base.

Perché il prelievo conta quanto il laboratorio

Un risultato microbiologico è affidabile solo se il campione è rappresentativo e integro. Il contenitore deve essere sterile e, per acque clorate, contenere tiosolfato che neutralizza il cloro; il campione va mantenuto al fresco e consegnato al laboratorio entro tempi brevi. Mani, rubinetto e tappo sono le fonti più comuni di falsi positivi: per questo è importante seguire con cura le istruzioni di prelievo: rubinetto pulito e disinfettato, acqua lasciata scorrere, nessun contatto con l'interno del tappo o del contenitore.

Norme e limiti di riferimento

Il D.Lgs. 18/2023 fissa per E. coli ed enterococchi intestinali il valore di 0 UFC in 100 mL; batteri coliformi, Clostridium perfringens e conteggio delle colonie a 22 °C sono parametri indicatori, che segnalano problemi di trattamento o di rete. Per la Legionella il decreto introduce un valore di parametro di 1.000 UFC/L nei sistemi di distribuzione domestici, che si affianca alle Linee guida nazionali del 2015.

Le norme UNI EN ISO elencate a lato descrivono, parametro per parametro, terreni, temperature, tempi e criteri di conferma.

Limiti del metodo

Alcuni batteri sopravvivono in uno stato vitale ma non coltivabile (VBNC), ad esempio dopo uno stress da disinfettante: la coltura non li vede, anche se in seguito possono tornare attivi. Per questo, in situazioni di emergenza o di ricerca, la coltura viene affiancata da metodi molecolari come la qPCR, che danno risposte più rapide ma con un significato diverso.