Coltura microbiologica su terreno selettivo

Principio fisico-chimico

Il metodo si basa sulla capacità di un microrganismo vitale di moltiplicarsi su un terreno nutriente in condizioni controllate, formando colonie macroscopiche conteggiabili a occhio nudo. L'uso di terreni selettivi (con sali biliari, antibiotici o pH controllato) e differenziali (con substrati cromogenici o fluorogenici) permette di distinguere specie e gruppi batterici.

Per E. coli si usano substrati come MUG (4-metilumbelliferil-β-D-glucuronide), idrolizzato dalla β-glucuronidasi a un prodotto fluorescente sotto UV.

Strumentazione

Cappa a flusso laminare classe II, sistema di filtrazione su rampa, autoclave per sterilizzazione, incubatori a 22 °C, 30 °C, 36 °C e 41 °C, contatore di colonie, microscopio per conferma morfologica, cabina UV. Per Legionella: incubatori CO₂, terreni BCYE con e senza cisteina, antibiotici GVPC.

Preparazione del campione

Per E. coli e coliformi si filtrano 100 mL di campione su membrana 0,45 µm sterile, depositata su terreno Chromocult o equivalente e incubata 21±3 ore a 36±2 °C. Per Legionella si filtra 1 L su membrana 0,22 µm in policarbonato, si effettua un trattamento termico (50 °C per 30 minuti) o acido (HCl-KCl pH 2 per 5 minuti) per inattivare la flora interferente, e si semina su BCYE-α e GVPC.

Calibrazione e validazione

Validazione con ceppi di riferimento ATCC (E. coli ATCC 25922, L. pneumophila ATCC 33152). Verifica della selettività e dei recuperi su matrici fortificate. Partecipazione a circuiti interlaboratorio almeno annuali (es. UNICHIM, LGC AQUACHECK).

Limiti di quantificazione e rilevabilità

Il LOQ è di 1 UFC/100 mL per E. coli, enterococchi e coliformi (limite 0/100 mL). Per Legionella la sensibilità è di 50 UFC/L con filtrazione di 1 L; per acque calde sanitarie con limiti di 1.000 UFC/L il margine è ampio.

Norme di riferimento

UNI EN ISO 9308-1:2017 per E. coli e coliformi totali con metodo a membrana filtrante; UNI EN ISO 7899-2 per enterococchi intestinali; UNI EN ISO 11731:2017 per Legionella; UNI EN ISO 6222 per carica batterica eterotrofa a 22 e 36 °C.

Quando si usa

La coltura è il metodo di riferimento normativo per la verifica del rispetto dei limiti microbiologici del D.Lgs. 18/2023, per HACCP, per Legionella in hotel/ospedali, e in qualsiasi situazione richieda la quantificazione di cellule vitali.

Quando NON si usa

Non è adatta per screening rapidi (preferire qPCR), per microrganismi VBNC o non coltivabili, per situazioni di emergenza dove servono risultati in giornata.

Confronto con metodi alternativi

Rispetto alla qPCR, la coltura misura cellule vitali e fornisce isolati per ulteriori test (sierotipizzazione, antibiogramma) ma è 30-50 volte più lenta. L'approccio integrato qPCR + coltura è oggi il gold standard per Legionella.