PCR quantitativa Real-Time

Principio fisico-chimico

La qPCR amplifica una sequenza specifica di DNA o RNA target attraverso cicli di denaturazione, ibridazione e estensione catalizzati da una DNA polimerasi termostabile. La quantificazione avviene in tempo reale misurando l'incremento di fluorescenza emessa da una sonda TaqMan (idrolisi) o da intercalanti SYBR Green ad ogni ciclo.

Il ciclo soglia (Ct) in cui la fluorescenza supera il fondo è inversamente proporzionale al logaritmo della concentrazione iniziale di target.

Strumentazione

Termociclatore Real-Time a 96 pozzetti con sorgenti laser/LED per 4-6 fluorofori, sensori CCD, software di analisi e controllo qualità. Cabina biologica di estrazione DNA, kit di estrazione automatizzati per filtri da 1 L (Legionella), sistema di filtrazione a vuoto.

Preparazione del campione

Per Legionella si filtrano 1-10 L di acqua su membrana 0,22 µm in policarbonato. La biomassa trattenuta viene sospesa, si effettua lisi cellulare con bead-beating o trattamento enzimatico, e il DNA viene purificato su colonne a scambio ionico o silice. Si aggiunge un Internal Amplification Control (IAC) per monitorare l'inibizione PCR.

Calibrazione e validazione

Curva di calibrazione con standard plasmidici a 5-6 diluizioni decimali (10¹-10⁶ copie/reazione). Verifica dell'efficienza di amplificazione (90-110%), linearità (r² > 0,99) ed esclusione di contaminazione con un controllo no-template (NTC) e un controllo positivo.

Limiti di quantificazione e rilevabilità

Il LOQ tipico per Legionella spp. è 100 unità genomiche per litro (GU/L), per L. pneumophila 50 GU/L. Si noti che la qPCR misura unità genomiche, che corrispondono al DNA di cellule sia vive che morte: il rapporto GU/UFC è generalmente compreso tra 1 e 10 a seconda dello stato del biofilm.

Norme di riferimento

UNI EN ISO 12869:2019 specifica la quantificazione di Legionella spp. e L. pneumophila in acque mediante qPCR. ISO/TS 12869 fornisce la procedura tecnica. Le linee guida nazionali (Accordo Stato-Regioni 2015) riconoscono la qPCR come metodo screening, mentre la coltura ISO 11731 resta il riferimento per la verifica.

Quando si usa

qPCR è indicata per screening rapidi di Legionella in hotel, ospedali e RSA, per gestione di emergenze (cluster di legionellosi), per monitoraggio post-sanificazione e per ricerca di patogeni non coltivabili.

Quando NON si usa

Non sostituisce la coltura nelle situazioni che richiedono la quantificazione di cellule vitali (UFC/L) ai fini del rispetto dei limiti normativi del D.Lgs. 18/2023 e degli accordi Stato-Regioni.

Confronto con metodi alternativi

Rispetto alla coltura ISO 11731, la qPCR è 30-50 volte più rapida e rileva anche specie di Legionella non coltivabili in laboratorio. Tuttavia non distingue cellule vive da morte; per superare questo limite si usa la qPCR con pretrattamento PMA (propidio monoazide) che inattiva il DNA da cellule lisate.