PCR quantitativa real-time

Come funziona

La reazione a catena della polimerasi (PCR) copia milioni di volte un tratto di DNA scelto perché presente solo nel microrganismo cercato, ad esempio il gene mip per Legionella pneumophila. Nella versione real-time una sonda fluorescente si accende ogni volta che il tratto viene copiato, e lo strumento registra a quale ciclo il segnale supera la soglia di fondo (ciclo soglia, Ct).

Il Ct è tanto più basso quanto più DNA bersaglio c'era all'inizio. Confrontandolo con una curva di taratura costruita con quantità note di DNA, si risale al numero di unità genomiche (UG) per litro di campione.

Dal campione al risultato

Per la Legionella si filtra un volume d'acqua noto (di solito da 1 litro in su) su una membrana che trattiene i batteri. Dalla membrana si estrae il DNA, che viene purificato e analizzato. A ogni corsa si inseriscono un controllo positivo, un controllo negativo e un controllo interno di amplificazione, che segnala se qualche sostanza presente nell'acqua ha bloccato la reazione e falsato il risultato.

L'intero processo richiede alcune ore di lavoro in laboratorio; il tempo complessivo per il cliente dipende soprattutto dal trasporto del campione.

qPCR e coltura: due risposte diverse

La coltura (ISO 11731) conta le colonie che crescono su terreno selettivo: misura solo batteri vivi e capaci di moltiplicarsi, ed esprime il risultato in unità formanti colonia per litro (UFC/L). La qPCR conta copie di DNA: include batteri morti, danneggiati o vivi ma non coltivabili. Per questo i due numeri non coincidono e di solito la qPCR dà valori più alti.

In pratica la qPCR è molto affidabile quando è negativa: un risultato sotto il limite di quantificazione rende molto improbabile una contaminazione significativa. Un risultato positivo, invece, va interpretato e spesso confermato in coltura. Esistono varianti con pretrattamento del campione (ad esempio con coloranti come il PMA) che riducono il segnale del DNA delle cellule morte.

Norme e quadro italiano

Il metodo per la Legionella è descritto nella specifica tecnica ISO/TS 12869:2019. Le Linee guida nazionali per la prevenzione e il controllo della legionellosi (2015) considerano la PCR utile come screening e nelle indagini su casi o cluster, mentre i valori di riferimento per le azioni correttive sono espressi in UFC/L e si verificano con la coltura. Lo stesso vale per il valore di parametro di 1.000 UFC/L introdotto dal D.Lgs. 18/2023 per i sistemi di distribuzione domestici.

Quando si usa e quando no

È utile per screening rapidi su molti punti, per la gestione di emergenze in ospedali, RSA e strutture ricettive, per verificare in tempi brevi l'esito di una bonifica e nella ricerca di microrganismi difficili da coltivare.

Non sostituisce la coltura quando serve un numero di batteri vivi da confrontare con i valori di legge o delle linee guida, né quando occorre isolare il ceppo per tipizzarlo e confrontarlo con quello di un paziente.