Sequenziamento 16S rRNA per profilo microbico

Principio

Il gene 16S rRNA è presente in tutti i batteri e gli archei. Contiene nove regioni variabili (V1-V9) separate da regioni conservate: con primer sulle regioni conservate si amplificano i tratti variabili, che cambiano da un gruppo batterico all’altro.

Le sequenze ottenute vengono confrontate con database tassonomici (ad esempio SILVA o GTDB). Il risultato è una tabella con la proporzione di ciascun gruppo batterico nel campione e alcuni indici di diversità.

Le piattaforme a lettura corta (tipicamente Illumina) sequenziano una o due regioni variabili; quelle a lettura lunga (come Oxford Nanopore o PacBio) possono leggere l’intero gene, di circa 1.500 basi, con una risoluzione tassonomica maggiore.

Preparazione del campione

L'acqua viene filtrata su membrana con pori da 0,2 µm circa, in condizioni che evitino contaminazioni. Nelle acque potabili la carica batterica è bassa, quindi spesso servono volumi di alcuni litri.

Il DNA viene estratto dal filtro con metodi che combinano rottura meccanica e chimica delle cellule. Per distinguere le cellule integre dal DNA libero si può usare un pretrattamento con propidio monoazide (PMA), che blocca l'amplificazione del DNA delle cellule con membrana danneggiata.

Fasi di laboratorio

Il flusso tipico comprende: estrazione del DNA, amplificazione PCR della regione scelta (per V3-V4 sono diffusi i primer 341F/805R), purificazione, preparazione della libreria, sequenziamento e analisi bioinformatica.

La parte bioinformatica (con strumenti come QIIME 2 o DADA2) comprende controllo qualità delle letture, riduzione del rumore in varianti di sequenza (ASV), assegnazione tassonomica e calcolo degli indici di diversità.

Ogni serie di analisi dovrebbe includere un controllo positivo (comunità batterica a composizione nota) e un controllo negativo (bianco di estrazione), perché con poca biomassa le contaminazioni dei reagenti possono pesare molto sul risultato.

Come leggere i risultati

Il dato è un'abbondanza relativa: dice che un genere rappresenta, ad esempio, il 2% delle sequenze, non quante cellule ci sono per litro. Un aumento percentuale di un gruppo può dipendere dalla diminuzione di altri.

Trovare sequenze del genere Legionella o Mycobacterium non significa che siano presenti specie patogene vive. Per una valutazione sanitaria servono metodi mirati: coltura, PCR quantitativa specifica, identificazione di specie.

Applicazioni nel ciclo idrico

Il 16S è usato soprattutto in ricerca e in indagini complesse: studio dei biofilm nelle reti di distribuzione, confronto dei profili microbici prima e dopo un trattamento (UV, ozono, filtrazione), valutazione della colonizzazione di filtri a carbone attivo.

In caso di contaminazioni di origine incerta, il confronto tra profili microbici di campioni diversi può aiutare a formulare ipotesi sulla sorgente, da confermare con altre analisi.

• Caratterizzazione dei biofilm in reti idriche di edifici complessi
• Studio dei filtri a carbone attivo come punti di proliferazione batterica
• Valutazione dell'effetto di un trattamento sulla comunità microbica
• Studi di resistenza antimicrobica, insieme alla metagenomica shotgun

Limiti e differenze con i controlli di legge

I parametri microbiologici del D.Lgs. 18/2023 (Escherichia coli, enterococchi, coliformi e altri) si determinano con metodi colturali normati. Il sequenziamento 16S non sostituisce questi metodi e non dà un giudizio di conformità.

Altri limiti: la PCR può amplificare alcuni gruppi più di altri, il numero di copie del gene varia tra specie, e la risoluzione si ferma spesso al genere. Per arrivare alla specie servono il gene completo o la metagenomica shotgun, che sequenzia tutto il DNA del campione senza PCR mirata.