ISO 11731 — Enumerazione di Legionella nelle acque

ISO 11731 è una norma internazionale pubblicata da ISO ed elaborata dal comitato tecnico ISO/TC 147 — Water quality, sottocomitato SC 4 — Microbiological methods. La prima edizione, ISO 11731:1998, era dedicata al solo metodo per acque associate a impianti tecnologici; nel 2008 era stata pubblicata la specifica tecnica ISO/TS 11731-2 per acque potabili a bassa carica. La revisione del 2017 ha unificato i due documenti in un unico standard, applicabile a tutte le matrici acquose.

In Italia la norma è stata recepita da UNI come UNI EN ISO 11731:2017 dopo l'armonizzazione in ambito CEN. È la norma di riferimento richiamata da ACCREDIA negli scopi di accreditamento dei laboratori per la prova 'Legionella spp.' su matrice acqua.

Il documento di riferimento per la prevenzione ed il controllo della legionellosi in Italia è l'Accordo del 7 maggio 2015 della Conferenza permanente per i rapporti tra lo Stato, le Regioni e le Province autonome, che ha approvato le 'Linee guida per la prevenzione ed il controllo della legionellosi'. Il documento sostituisce le linee guida del 2000 e introduce un approccio basato sulla valutazione del rischio (Valutazione e Gestione del Rischio Legionellosi — VGR), modellato sul Water Safety Plan WHO.

Il D.Lgs. 18/2023, in attuazione della direttiva (UE) 2020/2184, ha introdotto per la prima volta in Italia un obbligo di monitoraggio della Legionella nei sistemi di distribuzione interna degli edifici prioritari (strutture sanitarie, residenze socio-assistenziali, alberghi, campeggi, palestre, piscine, centri sportivi, mense, carceri, scuole). Il piano di controllo è definito dal gestore dell'edificio in base alla VGR e prevede il prelievo periodico di campioni di acqua calda e fredda nei punti più rappresentativi della rete.

Il campionamento è il punto più critico della determinazione di Legionella ed è specificamente disciplinato dalla UNI EN ISO 19458 (campionamento per analisi microbiologiche) e dalle linee guida nazionali 2015. Per la ricerca di Legionella si distinguono tipicamente due tipologie di prelievo: prelievo 'a flusso' (rappresentativo dell'acqua erogata, dopo flussaggio di 1-2 minuti) e prelievo 'a stagnazione' (rappresentativo dell'acqua residente nella tubazione e nel terminale, senza flussaggio preliminare).

Il volume tipico è di 1 litro per campione, raccolto in bottiglie sterili contenenti tiosolfato di sodio per inattivare il cloro residuo. La temperatura dell'acqua va misurata sul punto. Il campione deve essere trasportato a temperatura ambiente (non refrigerato) ed analizzato entro 48 ore dal prelievo. La catena di custodia documenta il punto di prelievo, la temperatura, il pH, il cloro residuo libero e totale.

Il metodo ISO 11731:2017 prevede la concentrazione del campione di acqua mediante filtrazione su membrana in policarbonato (porosità 0,2 µm o 0,45 µm a seconda della carica attesa) oppure mediante centrifugazione a 3.000-6.000 g. Il concentrato è suddiviso in tre aliquote: una sottoposta a trattamento termico (50 °C per 30 minuti) per ridurre la flora batterica concomitante, una sottoposta a trattamento acido (HCl/KCl pH 2,2 per 5 minuti) con la stessa finalità, e una non trattata.

Le aliquote sono seminate su terreni selettivi GVPC (Glycine, Vancomicina, Polimixina, Cicloeximide) e BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract con L-cisteina) ed incubate a 36 ± 2 °C in atmosfera umida per 7-10 giorni. Le colonie sospette sono confermate verificando la mancata crescita su agar BCYE senza L-cisteina (test della cisteina-dipendenza, caratteristica del genere Legionella). L'identificazione di specie e sierogruppo (Legionella pneumophila sierogruppi 1-15, altre specie) si effettua con antisieri commerciali, MALDI-TOF o PCR specifica. Il risultato è espresso come UFC/L con la formula UFC/L = (n colonie × 1000) / volume filtrato in litri.

Le linee guida nazionali 2015 definiscono soglie di azione differenziate per tipologia di struttura. Per strutture sanitarie (ospedali, RSA, lungodegenze) le soglie sono particolarmente stringenti: assenza di Legionella in tutti i campioni in reparti ad alto rischio (terapia intensiva, oncoematologia, trapianti), soglia di attenzione a 100 UFC/L e di azione a 1.000 UFC/L in reparti a basso rischio.

Per strutture turistico-ricettive (hotel, B&B, agriturismi, residence) la soglia di azione corrente è 1.000 UFC/L; sopra tale soglia è prevista la disinfezione dell'impianto (shock termico a 70 °C per 30 minuti su tutti i terminali, oppure iperclorazione a 50 mg/L per 1 ora) seguita da nuovo campionamento. Per palestre, piscine, vasche idromassaggio e fontane decorative valgono soglie specifiche per ciascuna tipologia. Le linee guida del 2015 raccomandano inoltre la notifica alle ASL competenti dei casi di superamento e la registrazione delle azioni correttive nel piano di autocontrollo.

Accanto al metodo colturale ISO 11731 esiste il metodo molecolare ISO 12869:2019, basato su qPCR (Polymerase Chain Reaction quantitativa) con primers specifici per Legionella spp. e per Legionella pneumophila. Il metodo qPCR rileva il DNA batterico (vivo o morto) in poche ore, contro i 7-10 giorni richiesti dal colturale, ed ha un limite di rilevazione molto basso.

Le linee guida nazionali 2015 considerano il qPCR utile come metodo di screening rapido o per indagini emergenziali (per esempio dopo un caso di legionellosi sospetto), ma per il monitoraggio di routine e per le verifiche di efficacia dei trattamenti di bonifica indicano il metodo colturale ISO 11731 come metodo di riferimento. La ragione è che il colturale conta solo le cellule vive e replicanti, mentre il qPCR può sovrastimare la carica conteggiando anche DNA di cellule non vitali, soprattutto subito dopo una bonifica termica o chimica.

L'analisi Legionella secondo ISO 11731 è oggi richiesta in modo sistematico ad hotel, B&B, agriturismi, residence, RSA e case di riposo, palestre con spogliatoi e docce, SPA con vasche idromassaggio, piscine pubbliche, centri sportivi e benessere, scuole con impianti centralizzati di acqua calda, ospedali e cliniche, condomini con impianto idro-sanitario centralizzato e accumuli di acqua calda sanitaria, impianti industriali con torri di raffreddamento evaporative.

Per le strutture turistico-ricettive il piano di autocontrollo Legionella è inoltre richiesto in molte regioni come condizione per il rilascio o il mantenimento della licenza di esercizio. La frequenza di monitoraggio raccomandata varia da semestrale ad annuale in funzione della VGR, con campionamenti aggiuntivi dopo qualunque intervento di manutenzione straordinaria, dopo chiusure stagionali prolungate o in occasione di segnalazioni di legionellosi nei clienti.

Il documento di riferimento è UNI EN ISO 11731:2017, acquistabile sul sito di UNI. Le linee guida nazionali del 7 maggio 2015 sono pubblicate gratuitamente sul sito del Ministero della Salute e dell'Istituto Superiore di Sanità. A livello europeo è disponibile il documento ECDC del 2017 'European Technical Guidelines for the Prevention, Control and Investigation of Infections Caused by Legionella species'.

Per il campionamento si fa riferimento a UNI EN ISO 19458:2006 (acque per analisi microbiologiche); per il metodo molecolare a ISO 12869:2019. La normativa europea sui prodotti biocidi utilizzabili per la bonifica degli impianti è il Regolamento (UE) 528/2012.