Cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem

Principio fisico-chimico

La cromatografia liquida con rivelazione tramite spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) accoppia due tecniche analitiche: la separazione cromatografica in fase inversa, basata sulla diversa affinità degli analiti per una fase stazionaria apolare (tipicamente C18) e una fase mobile acquosa-organica, e la rivelazione tramite due quadrupoli di massa in serie con cella di collisione interposta.

Gli analiti eluiti dalla colonna vengono ionizzati in sorgente Electrospray (ESI), positiva o negativa a seconda della molecola. Gli ioni precursori selezionati nel primo quadrupolo (Q1) vengono frammentati in cella di collisione (q2) con gas inerte, e i frammenti caratteristici vengono filtrati nel terzo quadrupolo (Q3) in modalità Multiple Reaction Monitoring (MRM).

Questa selettività su due livelli, combinata con la separazione cromatografica, consente di quantificare analiti a concentrazioni dell'ordine dei nanogrammi per litro anche in matrici complesse come acque sotterranee contaminate o reflui industriali.

Strumentazione

Un sistema LC-MS/MS dedicato alle acque comprende: un sistema HPLC o UHPLC con pompa binaria capace di pressioni fino a 1.300 bar, un autocampionatore termostatato, un comparto colonna a temperatura controllata, una sorgente ESI o APCI, e un triplo quadrupolo (QqQ) o un Q-TOF per workflow di ricerca.

La colonna analitica è tipicamente C18 da 100x2,1 mm con particelle 1,7-2,6 µm. Il consumo di solvente è ridotto (200-400 µL/min) e i tempi di corsa sono compresi tra 8 e 25 minuti a seconda del numero di analiti.

Preparazione del campione

Per le acque potabili la preparazione è generalmente minima: 200 mL di campione vengono fatti passare attraverso una cartuccia SPE (Solid Phase Extraction) WAX o HLB per concentrare gli analiti e rimuovere interferenti. L'eluato viene evaporato sotto azoto e ricostituito in 1 mL di metanolo-acqua.

Per i PFAS è cruciale evitare materiali in PTFE in tutta la filiera di campionamento e laboratorio, perché rilasciano contaminazione di fondo. Si utilizzano flaconi in HDPE o vetro silanizzato.

Vengono aggiunti standard interni isotopicamente marcati (es. 13C8-PFOA) prima dell'estrazione per correggere il recupero e gli effetti matrice.

Calibrazione e validazione

La calibrazione si effettua con almeno 6-8 livelli coprenti due-tre ordini di grandezza, valutando la linearità (r² > 0,99) e la robustezza al primo e ultimo punto della curva. La validazione del metodo richiede la stima di LOD/LOQ, accuratezza, precisione (ripetibilità intra-day e riproducibilità inter-day), recupero su matrici fortificate e robustezza.

Il laboratorio accreditato ISO/IEC 17025 deve documentare incertezza estesa di misura (k=2) e partecipare con esito positivo a circuiti interlaboratorio (proficiency testing) almeno annuali.

Limiti di quantificazione e rilevabilità

I LOD strumentali per PFAS in LC-MS/MS sono nell'ordine di 0,1-0,5 ng/L; i LOQ di metodo, dopo concentrazione SPE 200x, sono tipicamente 1-5 ng/L per i PFAS regolamentati dal D.Lgs. 18/2023, valore largamente sufficiente per verificare il rispetto del limite di 100 ng/L sulla somma di 20 PFAS e dei 500 ng/L sui PFAS totali.

Per i pesticidi polari (glifosato, AMPA) i LOQ sono dell'ordine dei 50 ng/L, contro un limite di legge di 100 ng/L per singola molecola e 500 ng/L per la somma.

Norme di riferimento

Il metodo di riferimento europeo per i PFAS in acque destinate al consumo umano è la ISO 21675:2019, integrata dalle linee guida della Direttiva UE 2020/2184 e dal D.Lgs. 18/2023 in Italia.

Negli Stati Uniti le metodiche di riferimento sono EPA 537.1 e EPA 533, mentre per i pesticidi polari si applicano le QuPPe (Quick Polar Pesticides Method) sviluppate dall'EU Reference Laboratory.

Quando si usa

LC-MS/MS è il metodo d'elezione per analiti polari, termolabili o non volatili a concentrazioni ultra-tracce. Si utilizza per i PFAS, i pesticidi polari, i farmaci e i loro metaboliti, gli interferenti endocrini e le micotossine.

È indicato anche per analisi forensi, dove la specificità MS/MS resiste a contestazioni tecniche in giudizio.

Quando NON si usa

Non è il metodo elettivo per metalli pesanti (preferire ICP-MS), per anioni inorganici (preferire IC) o per composti molto volatili come i BTEX e i clorurati (preferire GC-MS con purge & trap).

Per indagini di screening non-target su contaminanti emergenti sconosciuti è preferibile un Q-TOF o Orbitrap ad alta risoluzione rispetto al triplo quadrupolo.

Confronto con metodi alternativi

Rispetto a HPLC-DAD/UV, LC-MS/MS offre tre ordini di grandezza in più di sensibilità e identificazione molecolare oltre la corrispondenza di tempo di ritenzione. Rispetto a GC-MS, copre molecole polari e termolabili che non sono analizzabili in fase gas senza derivatizzazione.

L'investimento iniziale e i costi di gestione sono superiori, ma sono giustificati nei laboratori che operano sui PFAS e sui contaminanti emergenti.